嗜盐单胞菌（Halomonas spp.）是一类性质多样的嗜盐微生物，能够在高pH、高盐和高温等极端条件下生长。但在高盐和碱性条件下，非嗜盐微生物的生长受到抑制，因而嗜盐单胞菌能够抗杂菌污染，用于建立低能耗、低淡水消耗、低固定资本投入、低成本且能连续生产的开放发酵系统，是下一代工业生物技术开发的理想底盘生物。目前嗜盐单胞菌只能通过自噬质粒介导的两步同源重组进行改造，耗费时间长且效率较低，限制了它的应用范围，迫切需要一种更有效的基因编辑方法。因此，作者以Halomonas spp.为实验材料，利用CRISPR/Cas9系统建立了嗜盐单胞菌基因编辑方法。

作者以H. bluephagenesis TD01为实验材料。为了研究CRISPR/Cas9系统能否在目标点诱导双链断裂（DSB），以及细胞能否完成同源定向修复（HDR），作者用不同拷贝数的质粒（pSEVA321和pSEVA241）表达引导RNA（sgRNA），并用不同的启动子（Mmp1和CAS）表达Cas9。结果显示，在H. bluephagenesis TD01内，pSEVA241为高拷贝数质粒，每条染色体约355个拷贝；pSEVA321为中拷贝数质粒，每条染色体约75个拷贝。H. bluephagenesis转化的主要方式为接合，不能接受线性的DNA片段，因而供体DNA需要插入到sgRNA质粒才能进行转化。作者通过荧光定量PCR检测不同启动子调控下SpCas9的表达水平，结果显示Mmp 1启动子的强度为CAS的3倍。但与野生型相比，Mmp 1调控Cas9表达的菌株生长受到抑制，而CAS调控的菌株生长不受影响（Fig.1）。已有研究表明，启动子过强和Cas9表达量过高会降低转化和编辑效率，因而CAS启动子更适合于H. bluephagenesis基因编辑。为进一步验证上述实验结果，作者构建了聚羟基烷酸（PHA）合成酶基因phaC的gRNA，检验了不同的Cas9和sgRNA组合下HDR的效率和特异性，结果表明在CAS启动子下采用高拷贝质粒pSEVA241表达sgRNA和Cas9能够高效实现H. bluphagensis TD01的基因编辑。

除了H. bluephagenesis外，该系统还可以用于其他盐单胞菌的基因编辑。作者利用微调后的CRISPR/CAS9方法，在H. campaniensis LS21中删除了minC和minD基因，效率接近100%。minC和minD基因属于Min系统，该系统有助于细菌裂变成环，Z环的空间调节作用。当minC和minD被删除时，Min系统就会失效。在扫描电子显微镜下，H. campaniensis LS21野生型细胞的长度为2-3 µm，而H. campaniensis LS21（ΔminCD）的细胞长度为5-10 µm（图1），表明该方法适用于嗜盐单胞菌，甚至具有推广到其他嗜盐微生物的潜力。

Fig. 1. CRISPR/Cas9 system successfully used in H. campaniensis LS21 (a) Wild-type H. campaniensis LS21 (b) H. campaniensis LS21ΔminCD. Cells were cultured in 60 LB medium at 37℃for 24 h. Scale bar, 10 µm.

综上所述，作者开发一个快速、高效的CRISPR/CAS9系统，用于嗜盐细菌H. bluephagenesis和H. campaniensis的基因编辑。该系统经过微调后可以用于编辑其他嗜盐细菌，甚至可能推广到极端嗜盐微生物。该基因组工程系统将推进以极端嗜盐菌为底盘细胞的下一代工业生物技术的发展进程。