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YA3681 沙门氏菌延迟裂解系统 |
发布时间:2022-01-09 16:36:35 | 浏览次数: |
该裂解系统是由 Roy Curtiss Ⅲ [11-12] 实验室开发的一种基于抑制沙门菌细胞壁肽聚糖层合成的活疫苗裂解系统。二氨基庚二酸 (Diaminopimelic acid,DAP) 和胞壁酸 (Muramic acid) 是组成细菌细胞壁肽聚糖层必需的成分,asdA 基因编码一种合成 DAP 必不可少的酶,而 murA 基因编码胞壁酸合成途径的第 1 个酶 [13] ,二者的缺失将导致细菌无法合成细胞壁。Roy Curtiss Ⅲ团队首先利用 UK-1 鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhimurium 构建了 asdA 基因缺失株 χ8276[11] ,他们又在该菌株中引入了由 araC P BAD 启动子调控 asdA 基因表达的重组质粒 pYA3530。araC P BAD 依赖于阿拉伯糖(Arabinose) 的调控,在含有阿拉伯糖的培养基中菌株可以合成 AraC 蛋白,该蛋白可以激活启动子 P BAD 进而调控 asdA 基因的表达,使 ΔasdA 菌株仍然能够合成 DAP 维持完整的细胞壁结构;而在缺少阿拉伯糖的条件下,质粒上的 asdA 基因无法表达造成细菌细胞壁合成受阻而裂解死亡。在缺少阿拉伯糖的条件下,asdA 基因残留的转录水平 依 然 能 够 合 成 DAP , 于 是 该 研 究 团 队 将pYA3530 质粒上 asdA 基因的起始密码子 ATG 突变为 GTG 以降低 asdA 基因的转录水平。为达到组合 asdA 基因和 murA 基因的目的,Roy Curtiss Ⅲ团队在 P BAD 和 asdA 基因间插入了一段起始密码子优化的 murA 基因形成了质粒pYA3681。为了降低 asdA 基因和 murA 基因残留的转录水平,他们在 asdA 基因末尾的 3′端引入了来自 P22 噬菌体的启动子 P R 来指导反义 mRNA的合成,以此来关闭 asdA 基因和 murA 基因转录后的翻译过程。P R 启动子还会受到 C2 蛋白的阻遏,在 C2 蛋白存在的情况下 P R 的功能会受到抑制。他们将 pYA3681 引入到了具有 ΔasdA 突变的菌株 χ8937 中最终构建了自动裂解菌株 χ8937 (pYA3681)。该菌株在阿拉伯糖存在的条件下会激活 P BAD ,启动 murA、asdA 和 c2 的转录保证菌株正常合成细胞壁,产生的 C2 蛋白则会抑制 P22 P R启动子的功能;在缺少阿拉伯糖时,P BAD 由于无法被激活造成 murA、asdA 和 c2 的转录受阻,Asd、MurA 和 C2 蛋白无法继续合成而随着细胞分裂浓度降低,Asd 和 MurA 蛋白的减少导致 DAP 和胞壁酸无法合成,菌株因无法产生细胞壁肽聚糖层而裂解,C2 的减少激活了 P22 P R 启动子形成反义 mRNA 阻遏 Asd 和 MurA 蛋白的合成。为了测试调控延迟裂解系统递送抗原的效果,Roy Curtiss Ⅲ团队将携带有肺炎链球菌 Rx1 PspA 蛋白的调控延迟裂解沙门菌载体疫苗以口服的方式接种到小鼠体内,结果小鼠产生了针对 PspA 和沙门菌外膜蛋白的抗体反应,免疫 21 d 后检测到宿主组织内无疫苗细菌存在。
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