（1）结核分枝杆菌的细胞壁上含有大量分枝菌酸及脂质，导致细胞壁较其它细菌厚；（2）菌体生长周期长，代时约 24h，通常情况下需 4 周才能形成单菌落；（3）结核分枝杆菌的基因同源重组效率较低；

采用高滴度噬菌体特异性侵染的方法，构建敲除菌株。

该方法步骤如下：

1、构建带有目的基因序列上下游各 800bp 的 p0004S 质粒；

2、将构建成功的p0004S 质粒连接到 phAE159 质粒上；

3、噬菌体包装构建成功的 p0004S-phAE159质粒，即给构建成功的质粒 DNA 包裹上蛋白衣壳，形成完整有活性的噬菌体；

4、在耻垢分枝杆菌中扩增噬菌体并达到一定浓度；

5、高浓度的噬菌体侵染 H37Ra 感受态；

6、挑取单克隆并抽取基因组PCR验证敲除是否成功。