产品介绍

工业生产维生素D3是通过胆固醇转化为7-脱氢胆固醇，最终在紫外线辐射下转化为维生素D3。对比工业生产，微生物发酵合成维生素D3前体7-脱氢胆固醇(7-DHC)具有环保、溶剂需求少、副产物少等优点。

  近日，江南大学杨海泉课题组在“Biotechnology and Bioengineering”在线发表题为“Engineered yeast for efficient de novo synthesis of 7-dehydrocholesterol ”的文章，该研究改造酿酒酵母使其从头合成7-脱氢胆固醇，报道了迄今为止最高的7-脱氢胆固醇干重滴度，114.7mg/gDCW。

  作者利用GAL启动子过表达7个基因，分别为：DHCR24（Δ24-脱氢胆固醇还原酶）、ERG20（法炔基焦磷酸合酶）、tHMG1(HMG-CoA还原酶)、IDI1（二甲基烯丙基二磷酸异构酶）、ERG1（角鲨烯环氧化酶）和ERG11（羊毛甾醇14-去甲基化酶），以改善酿酒酵母的前体供应；并敲除ROX1基因（血红素依赖的缺氧基因抑制因子），所得到的菌株从葡萄糖中产生了82.6mg/L7-脱氢胆固醇。然后，通过基因组规模代谢网络模型重建的方法预测了7-脱氢胆固醇过量生产的5个基因敲除靶点。敲除GDH1基因(NADP+依赖性谷氨酸脱氢酶)使7-脱氢胆固醇滴度从82.6mg/L增加到101.5mg/L，ΔGDH1突变体的特异性生长速率也提高了28%。另外，在酿酒酵母中应用Ty1转座子增加ERG1基因和DHCR24基因的拷贝数，使7-脱氢胆固醇滴度增加120%，达到223.3mg/L。为了优化代谢通量分布，直接敲除竞争途径基因ERG6会抑制细胞生长，因此作者采用聚类规则间隔短回文重复干扰(CRISPRi)系统，通过靶向ERG6(△24-甾醇甲基转移酶)启动子进行动态抑制。与直接敲除ERG6相比，CRISPRi调控ERG6的细胞的OD600值提高了43%，在摇瓶中，7-脱氢胆固醇滴度提高到365.5mg/L。最后，在3L生物反应器中，作者通过补料分批发酵，在第一阶段以葡萄糖为唯一碳源，实现细胞快速生长；在葡萄糖耗尽时，通过添加乙醇从而增加乙酰辅酶A的供应，合成7-脱氢胆固醇。最终，7-脱氢胆固醇的发酵液滴度达到1328mg/L，干重滴度达到114.7mg/gDCW。

  综上所述，该研究通过基因组规模代谢网络模型预测基因敲除靶点，并利用CRISPRi系统重新分配代谢通量，以及应用酵母中的Ty1转座子提高DHCR24表达水平等方法实现酿酒酵母高产7-脱氢胆固醇。

（酿酒酵母中7-脱氢胆固醇的生物合成）

基本信息