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产品编号 | 产品名称 |
荧光素酶工作原理介绍 |
简介:
双荧光素酶报告基因检测是通常以萤火虫荧光素(Firefly luciferin,简称Fluc)为报告基因,以海肾荧光素酶(Renilla luciferase,简称Rluc)作为内参基因。Fluc以荧光素(luciferin)为底物,在Mg2+、ATP和O2存在下,可以催化luciferin氧化成oxyluciferin而发出生物荧光(bioluminescence)。在Fluc表达框的上游启动子区域插不同功能序列,可通过转录起始条件造成其荧光的变化;在Fluc的3’UTR区域插入待验证的靶序列,通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低,可以反映是否存在靶向互作。Rluc以腔肠素(coelenterazine)为底物,在O2存在下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide的过程发出生物荧光;通常由固定组成型启动子驱动,在报告系统中作为校正的内参信号。
双荧光素酶的应用方向
1、验证microRNA同mRNA靶向互作:将待测基因序列插入报告基因载体的3’UTR,再共转入microRNA,检测荧光素酶活性下降,则提示为其靶序列。
2、验证microRNA同lncRNA靶向互作:将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域,检测荧光素酶活性。
3、启动子结构分析:将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变,构建入报告基因载体,检测荧光素酶活性。
4、验证信号通路是否激活:将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体,检测不同上游条件下,其荧光素酶活性,即下游信号通路的响应情况。
5、验证转录因子同其调控序列:将该序列(通常为启动子序列)插入在报告基因载体中,同时在该实验细胞中共转转录因子,分析该转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。
双萤光素酶实验的具体步骤
1、报告基因质粒的构建:将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上;
2、转染细胞:将报告基因质粒和转录因子质粒共转染细胞;
当两种荧光素酶分别在两个载体上共转染时,由于内参具有很强的启动子,因此报告基因质粒:内参转染量一般为10:1~50:1。
3、提取蛋白,用于荧光素酶检测;
4、加入底物,Luciferase活性测定:
⑴ 初次使用时,配制荧光素酶测试试剂LAR II,即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中,并分装-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB裂解液,室温裂解细胞15 min。
⑶ 配制Stop&Glo,即Renilla luciferase的底物,能够终止LAR II的反应。
⑷ 测定荧光值:向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液,吹打混匀后,检测读数,即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo,再次读数,即为Renilla luciferase的值。
⑸ 数据处理:首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值,再以control组的比值为单位1,即可得到不同处理组的相对luciferase活性,也就是该处理组基因转录的调控活性。
双荧光素酶报告基因检测常用的载体有两种策略:
一、两种荧光素酶位于同一个载体上
哺乳细胞
pmirGLO(microRNA与mRNA,lncRNA靶向互作)
SV40启动子驱动hRluc的表达作为内参,PGK启动子驱动Luc作为报告基因,将待验证的元件克隆至Luc的3’端。
psiCHECK-2(microRNA与mRNA,lncRNA靶向互作)
HSVTK启动子驱动Luc作为内参,SV40启动子驱动hRluc作为报告基因,将待验证的元件克隆至hRluc的3’端。
植物
pGreen II-0800-Luc(启动子检测)
35S启动子驱动hRluc的表达作为内参,Luc作为报告基因,将待验证的启动子序列克隆至Luc的5’端,检测启动子的活性。
pGreenII-0800-miRNA(microRNA与mRNA,lncRNA靶向互作)
35S启动子驱动hRluc的表达作为内参,35S启动子驱动Luc作为报告基因,将待验证的元件克隆至Luc的3’端。
二、两种荧光素分别位于两个载体上:
内参载体pRL系列:可在哺乳细胞中组成型表达海洋腔肠荧光素酶Rluc,提供不同的启动子构型,可与萤火虫荧光素酶载体组合,作为报告基因的内参。在Rluc上游是一个T7启动子,可在体外合成Rluc的转录物。
pGL4.74
pRL-CMV
CMV启动子在多种细胞中可高强度、组成型地表达。
pRL-SV40
SV40启动子在多种细胞中可高强度、组成型地表达。
pRL-TK
HSV-TK启动子在胚胎和成熟的哺乳细胞中,可低水平、组成型地表达。
报告基因载体:将待验证的序列或元件插入到报告基因载体中,根据荧光素酶的活性反映检测的结果。
Luc2基因经过改造,去除大部分隐藏的转录因子结合位点,并通过编码优化提高了在哺乳细胞中的表达效率。Luc2P基因和Luc2CP基因在Luc基因的基础上增加了降解序列,可以调控Luc2基因在细胞中的半衰期,从而使基因对刺激的响应更快,但会影响其信号强度。Luc2基因半衰期为3小时,Luc2P基因半衰期为1小时,Luc2CP基因半衰期为0.4小时;其信号强度相反。
1、验证miRNA与靶基因3’UTR的结合:将靶基因3’UTR序列插入到荧光素酶的后面。
pMIR-Report Luciferase(CMV启动子)
pGL6-miR(PGK启动子)
2、验证miRNA同lncRNA靶向互作:将待测lncRNA序列插入到荧光素酶的前面。
pMIR-Report Luciferase(CMV启动子)
pGL6-miR(PGK启动子)
3、分析启动子/增强子:将启动子区域分段或突变,插入到荧光素酶前面。
pGL4.11[luc2P]
pGL4.14[luc2/Hygro]
pGL6
pGL3-Basic,不含启动子及增强子,将可能的启动子序列克隆到荧光素酶基因的上游,可测定其是否具有启动荧光素酶基因表达的活性。
pGL3-Promoter 含SV40的启动子可驱动荧光素酶基因表达。插入可能的增强子可增加荧光素酶基因的表达。
pGL3-Enhancer,在荧光素酶基因下游插入了SV40增强子,这可用于测定能增强荧光素酶基因表达的启动子。
pGL3-Control:含SV40的启动子及增强子,能产生高水平的荧光素酶基因表达。可作为检测转染频率的阳性对照。
4、验证转录因子同其调控序列:将调控序列(通常为启动子、增强子等调控元件)插入到荧光素酶前面,研究调控序列的基因转录调控活性。
pGL4.26[luc2-minP-Hygro]:
pGL4.27[luc2P minP Hygro]:
5、信号通路研究
Wnt信号通路
TopFlash:(Mini-TK promoter)
TopFlash用于检测Wnt信号通路中β-catenin介导的TCF/LEF转录活性水平,在荧光素上游有两组TCF/LEF结合位点序列,每组有三个重复序列,一组为正向序列,另一组是它的反向互补序列,可以高灵敏度地检测TCF/LEF的转录活性水平。TCF/LEF的转录活性水平与荧光素酶活性成正比,测定Wnt信号通路的激活水平。
FopFlash:(Mini-TK promoter)
FOPFlash质粒:在荧光素酶前面插入突变的TCF/LEF结合位点序列,是TOPFlash的阴性对照报告基因质粒。
pGL4.49[luc2P/TCF-LEF RE/Hygro]:
P53信号通路
pP53-TA-Luc:(TA promoter)
用于检测P53信号通路中P53转录活性水平,在荧光素上游插入P53结合位点序列。
JAK-STAT信号通路
pStat3-TA-Luc:TA promoter)
用于检测JAK-STAT信号通路中STAT3转录活性水平,在荧光素上游插入4个STAT3结合位点序列。
pGL4.52[Luc2P STAT5 RE Hygro]:
pGL4.47[luc2P SIE Hygro]:
SIE:sis-inducible element
pISRE-TA-luc:(TA promoter)
检测ISRE转录活性水平,在荧光素上游插入9个ISRE结合位点序列(GAAACT)。监测 Jak/STAT 介导的信号转导通路中STAT1和STAT2异二聚体的转录,STAT1和STAT2异二聚体与顺式作用的 ISRE 增强子元件结合后,转录被诱导,报告基因被激活。
TGF-β/BMP信号通路
pAP1-Luc:(TA promoter)
用于检测TGF-β信号通路中AP1转录活性水平,在荧光素上游插入6个AP1结合位点序列。
pGL4.48[luc2P SBE Hygro]
SBE:Samd-binding element
cAMP-PKA信号通路
pGL4.29-Luc2P-CRE-Hygro-CMV-EGFP
CRE:cyclic AMP response element,cAMP反应元件,参与多条信号通路;含有3个重复的CRE结合位点序列。
NFκB信号
pNFκB-TA-luc :用于检测NFκB信号通路中NFκB转录活性水平,在荧光素上游插入2个NFκB结合位点序列(GGGAA TTTCCGGGAA TTTCC)。
其他转录因子
pNFAT-TA-Luc(TA promoter)
用于检测NFAT信号通路中NFAT转录活性水平,在荧光素上游插入NFAT结合位点序列。
pE2F-TA-Luc(TA promoter)
监测 E2F 介导的信号转导途径,E2F是成视网膜细胞瘤基因 (Rb) 的主要靶点,E2F蛋白与DP1蛋白形成异二聚体复合物 E2F/DP1,与顺式作用的 E2F 增强子元件结合后,转录被诱导,报告基因被激活。
pGRE-Luc(TA promoter)
检测GRE糖皮质激素介导的信号通路激活水平,在荧光素上游插入GRE结合位点序列。
pGL4.42[luc2P HRE Hygro]
HRE:hypoxia response element 低氧反应元件,调节相关基因的转录表达,使细胞避免或适应低氧状态;含有4个重复的HRE结合位点序列。
pARE-luc:检测ARE(antioxidant response element,抗氧化响应元件)的转录活性水平,在荧光素上游插入了2个ARE结合位点(ACTGAGGGT GACTCAGCAAAATC),可以用于检测细胞的抗氧化水平或氧化应激状态。